聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，微生物PHAs)是酵法聚羟基脂进展一类由羟基脂肪酸单体通过酯化聚合得到的高分子化合物，因具有传统石油基塑料类似的生产力学特征、100%生物降解性和生物相容性而被认为是肪酸最有潜力的绿色环保材料之一。受限于其高昂的研究生产成本，PHAs作为绿色环保材料的微生物应用推广困难。文中分别从细胞形态调控、酵法聚羟基脂进展代谢途径构建、生产廉价碳源利用和开放式发酵技术开发等方面详细介绍了目前有效降低PHAs生产成本的肪酸方法。尽管大部分研究成果还局限于实验室阶段，研究但是微生物研究方法和方向为实现低成本PHAs的工业化生产提供了理论指导。
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，酵法聚羟基脂进展PHAs)是生产一类由羟基脂肪酸单体通过酯化聚合得到的高分子化合物，是肪酸微生物在特定环境下的能量储备物质。随着白色污染加重和石油资源枯竭，研究具有传统石油基塑料相似的力学特征、100%生物降解性和生物相容性的PHAs被认为是最有前景的绿色环保材料之一。目前只有少数工厂，例如德国Biomer Inc.、美国P&G、巴西PHB Industrial和中国Tianan Biologic等实现了PHAs的中试级别生产，但产量远远无法满足市场需求。主要原因是PHAs高昂的生产成本(2.2–5.0欧元/kg)大大限制了其作为绿色环保材料的应用。本文首先介绍了PHAs的类型和合成代谢途径，随后从细胞形态调控、代谢途径构建、廉价碳源利用和开放式发酵技术开发等方面详细介绍了不同研究团队在降低PHAs生产成本方面的研究成果，以期为实现低成本PHAs的工业化生产提供理论指导。
1 PHAs简介
1.1 PHAs分类
根据单体碳原子数PHAs可以分为短链PHAs(Short-chain-length，SCL)和中长链PHAs (Mediumlong-chain-length，MCL)，根据单体不同排列方式又可以分为均聚物(Homo polymer)、无规共聚物(Random copolymer)和嵌段共聚物(Block copolymer)。超过150种羟基脂肪酸可以作为PHAs合成的单体，其多元化组合赋予了PHAs性能的多样性，例如SCL PHAs材料坚硬易碎，MCL PHAs材料韧性良好，按照不同比例混合后的共聚物表现出不同的硬度和韧性，这为开发不同特性的产品提供了无限可能。
第一代商业PHAs，聚-3羟基丁酸酯(Polyhydroxybutyrate，PHB)是3-羟基丁酸(3HB)的均聚物，也是发现最早、研究最深入的PHAs材料。因为其良好的抗氧化性、防水性和较高的硬度，PHB材料主要被开发用作包装材料。但是它较脆的材质和接近降解温度(220℃)的熔解温度(175℃)不利于热加工处理。第二代商业PHAs是由3HB和3-羟基戊酸(3HV)无规则共聚而成的聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸酯(Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)，P(3HB-co-3HV))。
相比于PHB，P(3HB-co-3HV)在热加工性能、韧性和延展性方面均得到了提高。第三代商业PHAs是由3HB和中链3-羟基己酸(3HHx)无规则共聚合成的聚-3-羟基丁酸-3-羟基己酸(Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)，P(3HB-co-3HHx))。3HHx的混入给予了材料优异的弹性体性能和生物相容性能，因而被开发用作生物医用材料。随着PHAs研究的进一步发展，研究人员预测P(3HB-co-4HB)将会成为第四代商业PHAs，4HB的混入成功克服了PHB质地脆弱的缺点。目前PHAs已经用于塑料工业的包装材料、农业的农膜材料以及医药领域的组织工程和药物缓释材料等的加工生产中。
1.2 PHAs合成代谢途径
超过90个属的500种细菌具有PHAs合成能力，其中PHAs合成代谢途径主要有3条(图1，红色部分)。途径Ⅰ：从糖酵解途径(EMP)生成的两分子乙酰Co A (Acetyl-Co A)依次经β-酮基硫解酶(Pha A)和乙酰乙酰Co A还原酶(Pha B)，最后在PHA合酶(Pha C)催化下合成PHB。途径Ⅱ：同样以乙酰Co A为起点的脂肪酸从头合成途径(de novo synthesis)的中间产物参与PHAs的合成。该途径的关键酶3-羟基酯酰ACP-Co A转移酶(Pha G)将R-3-羟基酯酰ACP (R-3-hydroxyacylACP)转化为R-3-羟基酯酰Co A (R-3-hydroxyacylCo A)，从而被Pha C催化合成PHAs。途径Ⅲ：脂肪酸被活化成酯酰Co A后进入β-氧化(β-oxidation)途径，中间产物S-3-羟基酯酰Co A(S-3-hydroxyacyl-Co A)在差向异构酶作用下转换成可以被Pha C催化利用的R-3-羟基酯酰Co A。尽管部分微生物利用脂肪酸合成PHB，但是其主要利用β-氧化途径生成的乙酰Co A通过途径Ⅰ合成。
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除这3条主要途径外，微生物体内还存在其他PHAs合成途径，以及通过基因工程构建的新的PHAs合成途径(图1，蓝色部分)。例如从草酰乙酸(Oxaloacetate)出发，通过基因工程手段为P(3HB-co-3HV)的合成提供3-羟基戊酰Co A (3-hydroxyvaleryl-Co A，3HV)；从琥珀酰Co A (Succinyl-Co A)出发为P(3HB-co-4HB)合成提供4-羟基丁酰Co A (4-hydroxybutyryl-Co A，4HB)等。
2 微生物发酵法生产低成本PHAs
PHAs的生产成本集中在发酵物料的消耗和灭菌过程的能源消耗上，其中前者占成本的50%，后者占30%。基于此，各个研究团队希望通过降低发酵物料成本和灭菌过程能源消耗成本来降低PHAs的生产成本。例如提高菌株产率、利用廉价物料以及开发开放式发酵技术等。
2.1 细胞形态调控及代谢途径构建
作为胞内代谢产物，当盐单胞菌Halomonas campaniensis LS21内PHAs充满细胞体积时也仅达到生物量的60%，这表明PHAs积累量严重受限于细胞体积。研究人员发现通过抑制细胞分裂蛋白Fts Z，由杆状转变为丝状形态的重组大肠杆菌E.coli Trans1T1的PHB占比增加了125%。随后，Wu等发现基因min CD和细胞骨架蛋白Mer B也具有抑制细胞分裂和调控细胞形态的作用，重组大肠杆菌E.coli JM109内的PHB积累量达到生物量的80%。基因min CD和fts Z在PHAs生产菌株中同样具有影响细胞分裂和形态的作用。过表达min CD的重组盐单胞菌Halomonas TD08在静置培养下长成数百微米的丝状菌体，PHB含量从68.69%提升至82.04%，即使在振荡培养下菌丝长度依然是出发菌株的1.4倍。
为了解决Fts Z和Mer B非正常表达后细胞数量减少的问题，Jiang等构建了温度敏感表达质粒，菌体在30℃时正常生长到预定生物量后升高至37℃，Fts Z和Mer B表达受限，菌体细胞膜刚性遭到破坏、细胞分裂受到抑制，从细杆状转向粗丝状的菌体可以实现更多PHAs的积累。这一举措既实现了发酵前期生物量积累、发酵后期菌体存储空间增大的目的，又消除了基因工程手段对发酵前期细胞生长的负面影响。
除了形态调控，基因工程还适用于构建中间物的合成代谢途径。大部分菌株需利用多种碳源合成共聚物PHAs，例如在培养基中同时提供葡萄糖和丙酸才能获得共聚物P(3HB-co-3HV)。为了解决这个问题，Tan等强化苏氨酸合成途径的同时敲除2-甲基柠檬酸合酶，胞内丙酰Co A浓度上升，重组盐单胞菌TD01实现了单一碳源下P(3HB-co-3HV)的生物合成。同样的，在单一碳源下，Li等通过敲除琥珀酸半醛脱氢酶基因和过表达orf Z，胞内碳通量流向4HB-Co A的合成，为共聚物P(3HB-co-4HB)的合成提供前体。构建中间物的合成代谢途径，一方面避免了使用其他脂肪酸导致的原料成本增加和可能带来的毒性作用，另一方面为利用微生物直接合成多种类PHAs提供了指导方向。
声明：本文所用图片、文字来源《生物工程学报》2021年2月，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系
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